| 초록 |
□ 연구개요 뇌 특이적 지질 scramblase로 마카오 슬롯된 인간 TMEM16C 및 TMEM16F 단백질의 기능을 재조합된 리포좀 뿐 아니라 세포 수준에서도 측정 및 실시간 모니터링 하는 것임. 또한 이를 바탕으로 한 새로운 지질 scramblase의 조절 물질을 탐색 및 도출함으로 써, 관련 질환 및 장애의 새로운 치료방법을 제시하고자 함. 이를 위해 TMEM16 단백질의 특정 유전자 (뇌 특이적 splicing variants)를 확보한 뒤, 다양한 생화학, 생물물리학, 세포생물학 및 광학적 실험을 종합하여 그 기능을 확인하고자 함. □ 연구 목표대비 연구결과 지질 수송을 실시간으로 모니터링 하기 위한 어세이법을 구축하기 위해 293T 세포주에 내재하는 TMEM16F 유전자를 삭제한 세포주를 CRISPR/Cas9 시스템을 활용하여 구축함. 293T 세포주에 내재하는 지질 scrambling 기능을 배제하고 과발현 시킨 유전자의 지질수송 능력만을 측정하기 위해 다양한 종류의 Ca<sup2+</sup 농도와 ionomycin 농도를 테스트 하였고, 최종적으로 실험에 적합한 조건을 도출함. 인간에는 마우스에서는 발견되지 않는 새로운 TMEM16C variant가 존재함을 인간 뇌 cDNA에서 RT-PCR을 통해 검증하였고, 이 variant는 기존의 마카오 슬롯와는 달리 Phosphaditylserine을 Ca<sup2+</sup 의존적으로 수송할 수 있음을 조사함. 또한 인간 TMEM16 단백질을 인간 세포주에서 발현 및 정제 할 수 있는 시스템을 구축하기 위해 바큘로바이러스를 생산하였으며, TMEM16C 단백질 정제에 적합한 계면활성제를 탐색하고 다양한 태깅 시스템을 활용하여 TMEM16C 정제를 시도함. Digitonin을 사용하여 TMEM16F variant 1 및 TMEM16F variant 2 단백질을 정제하는데 성공하였으며, 이들의 기능을 리포좀에 기능적으로 재조합 한 뒤 조사함. 정제된 단백질을 활용하여 새로운 결합 펩타이드를 탐색하고자 하였음. 추가적으로 배양된 마우스 신경세포 및 안건 성상교세포 (SVG p12), 미세아교세포 (HMC3)에서 내재하는 지질 수송능력을 조사함. 각 세포에 필요한 Ca2+ 및 ionomycin 농도를 비교함으로써 세포마다 지질 수송을 담당하는 서로 다른 타입의 TMEM16 단백질이 존재하고 있음을 유추해 낼 수 있었음. □ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성) TMEM16 단백질의 구조-기능 상관관계 연구 및 조절물질을 통한 기능 제어 기술 개발 - 구축한 TMEM16C 영구 발현 세포주를 활용하여 지질 scrambling을 조절 할 수 있는 화합물 및 천연물 스크리닝 - 조절물질에 의한 단백질의 구조변화 탐색을 통한 새로운 지질 수송 기전 제시 조절 물질을 활용한 새로운 치료제 개발 - 단백질 순수 정제 조건 확립에 따른 리포좀 수준에서 TMEM16 단백질의 기능 조절 확인함으로써 보다 직접적인 기능 조절 여부를 조사할 수 있음 - 새로운 바이러스 치료제 및 치매 치료제 개발로의 기대 (출처 : 연구결과 요약문 2p) |
