| 초록 |
□ 연구개발 목표 및 내용 ◼ 최종 목표 ① 본 연구실에서 관찰된 고농도의 Ca<sup++</sup(1.5-2M) 존재하에서 얻어지는 DNase I의 구조적 안정성 (resistance to denaturation by temperature)과 단백질 분해효소에 대한 저항성에대한 원리를 규명함으로써 ② 유도된 안정성 또는 창출된 안정화된 DNase I을 이용한 순수분리법을 개선하여 현재 문제가 되고 있는 순도를 완벽하게 하고 (시약의 경우, 순도에 따른 가격차: 3,000배) ③ virus 감염증의 정확한 진단과 빠른 검색에 문제가 되는 DNase I처리가 포함된 검체 전처리과정을 개선하고 ④ cystic fibrosis의 치료에 절대적으로 사용되는 DNase I의 현재 문제점 즉 생체 내 delivery와 휴대 (냉장 불필요) 간편성을 도모한다 ◼ 전체 내용 Ca++ 에 의한 안정화를 이용한 정제 방법의 개발 1) Ca++존재 하에 autolysis를 통한 정제 2) Lima bean affinity chromatography를 사용한 완전한 protease의 제거와 일부 RNase의 제거 3) pUp (agarose-5′-(4-aminophenyl-phosphoryl)-uridine 2′(3′)-phosphate) affinity column을 통한 RNase의 제거 4) rh DNase I (human DNase I)의 cloning과 대량생산 5) rh DNase I의 정제과정 개발 DNase I에 존재하는 Ca++ 부착부위의 동정 6) Ca++ 결합부위동정 7) 고온과 2M Ca++이상의 농도에서 denaturation정도에 따른 안정화 결합부위 동정 □ 연구개발성과 기존에 소의 췌장에서 전 처리 후 5개 이상의 chromatography과정을 거쳐 정제던 것을 고 농도 (2.5 M Ca++)의 존재, pH, 고온 그리고 적절한 처리시간에서 autolysis시킴으로써 (다른 혼입 단백질의 denaturation도 유도함) 전구체인 chymotrypsinogen을 포함한 혼입단백질을 상당부분 제거하여 전 처리 과정을 줄이고 뿐만 아니라 chromatography과정을 1.2 step으로 줄이고도 고도 정제된 DNase I의 대량 생산을 용이하게 하였고 또 그 제조 비용을 획기적으로 줄였다. 뿐만 아니라 bDNase I과 rhDNase I을 35, 50 mg/L culture로 대량생산하고 이를 순수분리하여 모든 다른 혼입효소 활성을 없앴다. 이렇게 대량생산된 DNase I은 glycosylation된 효소에 비해 약 95%이상의 활성을 보임으로써 제품으로도 손색이 없었음 □ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과 ① 높은 Ca++농도에 따른 안정화와 안정화가 보장된 새로운 DNase I의 창출은 정제과정을 효율적으로 하여 순도에 따라 3,000배의 가격차이를 보이는 시약시장을 공략하고 또 이를 채용한 DNase I을 사용한 실험의 성공률과 효율성을 증대할 것이다. ② 새롭게 창출된 DNase I은 현재 문제가 되고 있는 RNA virus의 검색 및 확인 그리고 진단의 효율성과 정확성을 증진할 수 있을 것이다. ③ Cystic fibrosis 및 lupus의 증세 완화와 치료에 쓰이는 DNase I (dornase alfa)는 새롭게 창출된 rh DNase I를 통해 새로운 제재를 창출할 수 있을 것이다 (출처 : 요약문 2p) |
